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寡核苷酸已成为商品，其合成成本低，因此每次检测评估多个正向和反向引物是可行的。我们建议每种类型应该有三个引物，从而形成九个引物组合。
图2 |艰难梭菌tcdB基因引物的选择。
(相关资料图)
A.使用BeaconDesigner(PremierBiosoft)设计三个正向引物(CD1、3和5)和三个反向引物(CD2、4和6)。
B.使用所有九种可能的引物组合重复扩增从艰难梭菌630(CP010905.2)提取的相同区域的染色体DNA，同时使用合适的NTC。
C.使用Agilent Brilliant III SYBR Green master mix(目录号600882)进行扩增和溶出曲线条件。
d、CD1/2(绿色)和CD5/4(蓝色)用于扩增，分别记录最低和最高Cqs。只有一个NTC记录的Cq为45。
E.最敏感和最不敏感引物组合之间的Cq范围是6.2。因此，优选的引物对是CD1/CD2。CD5/4是最不理想的引物组合。
图2显示了实验结果，其中初步筛选了艰难梭菌tcdB基因(KC292190.1)的三个正向和三个反向引物，并评估了灵敏度(由定量周期(Cq)确定)和引物二聚体形成的可能性(由无模板对照(NTCs)的扩增确定)。
结果表明，引物序列的微小差异可以极大地影响检测的灵敏度，在这种情况下灵敏度是70倍(高Cq和低Cq之间的差异是6.19)。
尽管对于许多分析来说，引物的浓度可以变化很大，而不会对PCR的性能产生明显的影响，但是如果靶的拷贝数低或者为了提高特异性，优化引物的浓度是很重要的。
在测试了大量的检测方法后，我们观察到最差和最佳引物浓度之间的δδCqs变化很大，大约5倍被估计为工作平均值，尽管它可以大得多。
我们没有看到一个引物组不能优化至少一点点(2倍)，但我们也看到几个引物组的优化产生了巨大的差异，使灵敏度提高了100多倍。
因此，我们的建议是，作为验证任何新引物组的常规部分，值得进行这个额外的步骤，除非确定靶将大量存在。
但是，虽然引物浓度的变化会对PCR结果产生显著影响，但引物浓度并不能成为PCR实验可能成败的主要原因。图3所示的结果证明了这一点。只要引物浓度保持在约200-400nM的通常范围内，灵敏度的差异将小于4倍。
图3 |引物浓度对qPCR测定的影响。
A.使用安捷伦的Brilliant III SYBR Green mastermix(目录号600882)和引物TCD-f:agagttggtagaaaggtggaatttag和t CD-R。抗艰难梭菌630(CP010905.2)的ACATACCACCAATTTCTTTTAATGC的tcdB毒素基因(HM062503.1)。引物slpa-f:attagattattatttttttctaaattat和slpA-r . cctgttttgctgcaactact针对艰难梭菌S层蛋白的slpA基因(AB258978.1)，用于扩增从艰难梭菌630(CP010905.2)中提取的染色体DNA。
放大图和溶解曲线。如果F或R引物的最终浓度保持在100nM，就会得到绿色光谱，这说明至少对于这个引物组来说，100nM太低了。
C、Cq和引物浓度之间的关系表明，200 nm和400nM处的最终引物浓度之间几乎没有差异。
不建议将引物的浓度降低到100纳米以下。如图4a所示，一种引物的最终浓度为50nM，导致检测灵敏度显著降低。
图4 |引物浓度对qPCR检测的显著影响。引物slpA-F和slpA-R针对艰难梭菌S层蛋白(AB258978.1)的slpA基因，用于扩增从艰难梭菌630(CP010905.2)中提取的染色体DNA。
A.使用安捷伦的Brilliant III SYBR Green mastermix(目录号600882)进行扩增和溶出曲线条件。
B.使用1 103个靶拷贝获得的扩增图和溶出曲线(插图)。用50nM F引物的终浓度获得三个蓝色扩增图谱，而分别用100 nm F引物和200nM F引物的终浓度获得绿色和棕色图谱。
C.使用1 108个靶拷贝获得的扩增图和溶出曲线(插图)。
不同靶浓度之间的d，Cqs被不同浓度的引物扩增。
有趣的是，与图3中的例子相比，对于该引物组，100 nM的最终浓度并没有导致灵敏度的显著降低。
这些结果还表明，太低的引物浓度会影响检测的线性。
图4b显示了当使用1×105倍模板时，通过使用相同的引物浓度获得的结果。
除了50nM的引物浓度之外，对于所有其他引物浓度，两个实验条件之间的预期δ CQ为13.3，并且差异高得多(图4d)。
同样，结论是结果很大程度上取决于引物。如果目标是将灵敏度与精确定量相结合，仔细优化引物浓度将变得很重要。
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