聚合酶链反应（PCR）是一种DNA聚合酶体外扩增特异性DNA片段。PCR技术操作简单，可在短时间内获得数百万份特定靶DNA序列。20世纪80年代中期，PCR技术的发明引发了生物技术发展的一场革命，生物技术已广泛应用于与分子生物学相关的各个领域。
PCR反应的几个要素
PCR反应步骤
PCR反应条件
PCR反应成分
1、模板
模板可以是DNA或RNA（逆转录PCR），可以是双链或单链。未混合蛋白酶核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
2、TaqDNA聚合酶（Taq酶）
DNA聚合酶的主要活性是在模板、引物和dNTP存在下催化DNA合成。嗜热细菌NicholasTse的Taq酶
三底漆
引物浓度：0.1-0.5μmol/l。浓度过高可能导致模板与引物不匹配，反应的特异性降低。
底漆设计：
（1）该引物序列特异性好，与非扩增区无同源性。
（2）底漆长度应为15-40BP。
（3）碱基尽可能随机分布，GC占40-60%。
（4）底漆Tm在50℃-65℃之间。两种底漆的喷射力应相近，且差异不应太大。
（5）底漆中应避免二次结构。
（6）两个引物之间应避免互补序列。
（7）引物3’端应与模板序列严格配对，3’端应避免3个或更多连续的相同碱基；底漆的5’端没有严格限制。
4、dNTP
dNTP：dATP、dTTP、dGTP、dCTP
DNTP浓度取决于扩增片段的长度
四种dNTP浓度应相等
如果浓度过高，则会添加错误的碱，如果浓度过低，则会降低反应产率
DNTP可与Mg2结合，降低游离Mg2的浓度，影响DNA聚合酶的活性。
5、Mg2
Mg2是DNA聚合酶的激活剂。Mg2浓度过低，Taq酶活性下降，PCR产率降低；高Mg2会影响反应的特异性。Mg2能与负离子结合，因此反应体系中dNTP、EDTA等的浓度会影响反应中游离Mg2的浓度。
六缓冲器
10mmol/ltrishcl调节pH值，以在平坦的碱性环境（ph8.3，室温）中保持Taq酶的活性
50mmol/LKCl有利于引物退火，但过高的KCl会抑制Taq酶的活性
0.01%明胶保护酶的不变性失活
7、扩展
70-75℃（温度取决于聚合酶活性）
延长时间由扩增片段和DNA的长度决定
(资料图片)
聚合酶的延伸速度决定
3.1.8循环次数
主要取决于模板DNA的浓度
一般25-35次
次数过多：放大效率降低
错误合并率增加
PCR常见问题解答
1、无扩增产物
现象：阳性对照有条带，但样品无条带。
2、非特异性扩增：
PCR扩增之后出现的条带与预期大小不一致，无论大小，或同时出现特异性和非特异性扩增条带。
3、尾矿
现象：产品在凝胶上处于涂抹状态
4、假阳性（筛选转基因和检测基因表达）
现象：空白对照中出现目标放大产物
原因：目标序列或扩增产物交叉污染
对策：
（1）操作过程中小心地轻轻揉捏目标序列，防止其吸入取样枪或从离心管中溅出
（2）除不能耐受高温的酶和物质外，所有试剂设备应在高压下灭菌。使用的所有离心管和取样枪头应为一次性
（3）最好先重新包装各种试剂，然后低温保存
注意事项
（1）少量分装吸头和防污染试剂EP管的一次性器具和工作区应进行分离和无菌操作
（2）设置比较
阳性对照：阳性模板
阴性对照：阴性模板
试剂控制：除模板外的所有组件
不同类型的PCR
1、重组PCR
2、反向PCR
3、多重PCR
4、接地PCR
减少PCR通过在PCR的前几个周期中使用严格的退火条件来提高特异性。循环设定为比预计的喷射力高5℃左右从退火温度开始，然后在每个循环中降低1-2℃，直到退火温度低于JetLi5℃。特异性最高的目标模板将优先扩增，这些产物将在随后的周期中继续扩增。对于那些不知道引物和目标模板之间同源程度的方法，如AFLP，减少PCR更有用DNA指纹分析等。六点五热启动PCR
热启动主要通过抑制一种基本成分来延迟DNA合成，直到PCR仪器达到变性温度；该酶具有热启动特性，使用方便，适合高通量应用；除了良好的引物设计外，热启动PCR是提高PCR特异性的重要方法之一。
五RT-PCR
RNA聚合酶反应（RT-PCR）是以RNA为模板的逆转录（RT）和PCR的结合。它可以用来检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的RNA模板。RNA扩增步骤：由单个引物和在逆转录酶的催化下，RNA互补的合成加热cDNA后，cDNA从RNA链上解离，然后用另一个引物退火，DNA聚合酶催化引物的延伸生成双链靶DNA，最后扩增靶DNA
一步：
使用相同的缓冲液，将逆转录酶、引物、Taq酶和四种dNTP添加到同一系统中进行直接分析MRNA逆转录和PCR扩增。Taq酶不仅具有DNA聚合酶的作用逆转录酶活性可以在同一个系统中以mRNA为模板直接反转录，然后再以AndyLau为模板，从而简化mRNA的PCR步骤。所需的样本量减少到了最低限度，对小型临床样本的检测非常有益。一步扩增可检测到总RNA中小于1ng的低丰度mRNA。该方法可用于检测cDNA文库的构建和特异性cDNA的克隆可与Taq酶的测序技术相结合，使基因转录本的自动反转录、基因扩增和测序可以在单管中进行。
两个步骤：
由于单管反应中的RT和PCR不能在最佳条件下进行，且容易相互干扰，因此通常适合使用基因特异性引物扩增较短基因和定量PCR。两步法则是分别进行RT和PCR，使这两个反应充分发挥各自的特点，更加灵活、严谨，适用于GC含量严重、二级结构未知或模板未知的模板，以及多基因的RT-PCR。
